石墨烯碳量子点用于氟喹诺酮类抗生素的荧光检测

李港，胡玉峰

(大连理工大学 海洋科学与技术学院，辽宁 盘锦 124221)

氟喹诺酮类抗生素(FQs)作为一种人畜共用的药物被广泛使用，然而进入人体或动物体内的FQs，70%未被代谢而通过排泄释放到环境中，在我国水环境中常有痕量残留[1]，因此建立针对FQs的快速检测方法对于保证人类和环境健康具有重要意义。目前，抗生素的检测方法主要有细菌分析法、化学仪器分析法、免疫分析法，但这些方法或操作复杂，或灵敏度不足，或仅能检测特定目标物[2-6]。石墨稀碳量子点(GCDs) 因其生物相容性、发光性 (PL)以及分散性被广泛运用到各个领域[7-8]。在FQs检测方面有很大的潜力[9-10]。目前，水热法是最常用的GCDs制备方法[11]。制备过程中所采用的原材料、反应条件等，对GCDs荧光性质及表面官能团种类具有很多影响[12-15]。

本研究拟通过对GCDs制备方法的优化，得到对FQs具有荧光响应的GCDs，并对其荧光特性进行表征，探索其作为荧光单体用于定量检测FQs的可能性，为环境中FQs的快速筛查奠定基础。

1.1 试剂与仪器

过氧化氢(30%)、二氧化锰、氧化石墨烯(GO)均为分析级；
氧氟沙星(OFL)，购自百灵威科技有限公司；
恩诺沙星(ENR)、环丙沙星(CPR)，均由上海源业生物科技有限公司提供；
诺氟沙星(NOR)，购自梯希爱(上海)发展有限公司；
实验用水为超纯水。

F-7000荧光分光光度计；
Tecnai G2F30透射电子显微镜(FEI)；
UPTA-20超纯水机。

1.2 GCDs的制备

将20 mg氧化石墨烯溶于20 mL超纯水中，加入5 mL 30% H2O2溶液，超声分散30 min。将混合物转移至100 mL聚四氟乙烯内衬中，并置于高压釜室中，在180 ℃ 下保持90 min，冷却至室温。用 0.2 μm 滤膜过滤，滤液转移至透析袋(截留分子量3 500 Da)中。将适量的MnO2用超纯水溶化后，投入另一个透析袋中，用作去除反应剩余过氧化氢的催化剂。把两个透析袋封闭起来，一起放进装有超纯水的烧杯内，避光静置。待烧杯中不再产生气泡时，将装有GCDs溶液的透析袋取出，用超纯水冲洗透析袋表面，去除二氧化锰，透析袋中的液体即为制备的GCDs溶液，置于冰箱中冷藏待用。

1.3 GCDs的表征

使用荧光分光光度计在360 nm激发下获得荧光光谱，其中光电管电压为700 V，扫描速度为 1 200 nm/min，激发单元狭缝宽度设置为5.0 nm，发射单元狭缝宽度设置为5.0 nm。除特殊说明外，实验过程中的荧光光谱获取均为此参数设置。使用透射电子显微镜拍摄TEM图像。

1.4 实验方法

将1.2节中制备的GCDs溶液，冷藏避光保存，并定时定量取出，使用荧光分光光度计检测其荧光强度，记录其在120 min内的变化。

配制一系列浓度梯度为10%的GCDs溶液(10%～90%)，加入定量FQs，振荡培养120 min，用荧光分光光度计检测其荧光强度，记录荧光强度的变化，并根据结果，分析GCDs用于FQs检测时的最优条件。

在最优GCDs浓度与最优培养时间下，将GCDs用于多种FQs的定量检测，绘制FQs浓度-F/F0标准曲线，计算GCDs对多种FQs的检测限。

2.1 GCDs的制备

GCDs制备时的加热时间对于材料的荧光性能有非常大的影响，实验见图1。

图1 不同加热时间制备的GCDs照片(a) 与荧光发射光谱图(b)Fig.1 Physical diagram(a) and fluorescence emission spectrum(b) of GCDs at different heating time

由图1可知，随着加热时间的增加，溶液颜色由深到浅，同时GCDs量子点荧光强度增加，在85 min时达到最大值，而当加热时间继续延长至90 min时，溶液则不再有荧光信号，这是因为该制备反应本质上是将微米级尺度的氧化石墨烯切割为纳米级尺度的石墨烯碳量子点的过程。当加热时间从70 min 增加到 90 min 时，获得了一系列的产物，尽管实验中已经通过滤膜去除了大尺度的残留物，但还是有各种不同尺度的产物保留了下来，因此，这实际上是一个混合体系的荧光测量。作为原料的氧化石墨烯溶液为棕黄色，没有任何荧光，加热70 min 时，溶液仍保持棕黄色，但是主要表现出500 nm处的绿色荧光，加热时间到85 min 时，溶液为淡黄色，并且 450 nm 处的蓝色荧光也增强，加热时间到达90 min 后，溶液为无色透明状态，并且几乎没有任何荧光，这表明氧化石墨烯全部分解为了小分子物质，不再具有荧光性能。因此，确定GCDs最佳制备时间为85 min。

图2是GCDs的TEM图。

图2 GCDs的TEM图(a、b)和尺寸分布(c)Fig.2 TEM diagram of GCDs and size distribution of GCDs a.20 nm；
b.5 nm；
c.GCDs尺寸分布

由图2可知，GCDs尺寸分布比较均匀，集中在5～10 nm。由GCDs高分辨的表征，由图2b可知，GCDs有明显的晶格线条纹。通过多处取像，并对GCDs尺寸进行统计，由图2c可知，GCDs尺寸集中在6～8 nm。

2.2 GCDs的稳定性

取10 mL GQDs溶液避光静置，分别在0，10，20，30，45，60，90，120 min时，各取1 mL GQDs溶液置于荧光分光光度计中获取荧光光谱，结果见表1。

表1 GCDs稳定性Table 1 Stability of GCDs

由表1可知，GCDs在120 min 内荧光强度几乎不发生改变。后续研究中，实验时间应控制在 120 min 内。

2.3 GCDs使用条件的优化

以诺氟沙星(NOR)作为氟喹诺酮类抗生素的代表物进行实验。

2.3.1 GCDs的使用浓度 在10%～90%浓度范围内，按照浓度梯度为10%(v/v)配制GCDs溶液各2份，并向其中1份加入NOR溶液，NOR在体系中的终浓度为100 μmol/L，振荡培养15 min后，测量体系的荧光强度，结果见图3。

由图3可知，当存在NOR时，GCDs的荧光强度出现增强，当NOR浓度不变，GCDs浓度增加，则NOR对GCDs荧光增强的响应逐渐减弱。GCDs浓度为10%时，NOR对其的荧光增强效果最佳，但是此时GCDs的初始荧光强度较低，会导致荧光光谱仪数据测量的不准确性。当GCDs浓度为90%时，NOR对其的荧光增强效果最差，这是由于体系中GCDs的量远高于NOR，从而导致增强效果减弱，不利于对NOR的检测。因此，综合两者之后，后续实验采用 50% 作为最优浓度使用。

图3 不同浓度条件下GCDs-NOR体系的荧光强度变化Fig.3 Changes of fluorescence intensity of GCDS-NOR system at different concentration of GCDs

2.3.2 培育时间 配制含有GCDs(浓度为50%)、NOR(50 μmol/L)的混合溶液9份，并立即振荡，分别于配制后1，5，10，15，30，45，60，90，120 min 时，测试各混合溶液的荧光光谱。同时采用浓度为50%的GCDs溶液作为对照，结果见图4。

图4 不同培育时间的GCDs-NOR体系荧光强度变化Fig.4 Changes of fluorescence intensity of GCDS-NOR system at different incubation time

由图4可知，当GCDs用于NOR的检测时，体系的荧光强度在1 min内即可达到最大值，且在 10 min 内维持不变，说明GCDs能够非常快速地对诺氟沙星做出荧光响应，之后随时间增加，荧光增强逐渐降低，并在45 min 之后基本保持稳定。因此，为便于操作和获取更加稳定的荧光信号，在后续实验中均采用10 min作为培育时间。

2.4 GCDs用于氟喹诺酮类抗生素的检测

配制浓度为0，5，10，15，20，30，40，50 μmol/L的NOR、OFL、ENR或CPR的溶液，按2.3节中的最优条件，与GCDs溶液混合，测定体系的荧光强度。测试条件如下：激发波长360 nm，发射波长范围为380～700 nm，光电管电压为700 V，扫描速度为 1 200 nm/min，激发单元狭缝为2.5 nm，发射单元狭缝5.0 nm。结果见图5和图6。

图5 不同浓度的NOR、OFL、ENR和CPR存在时，GCDs溶液的荧光波谱图Fig.5 Fluorescence spectra of GCDs solution with different concentration of NOR，OFL，ENR and CPR a.NOR；
b.OFL；
c.ENR；
d.CPR

由图5可知，在浓度范围为0～50 μmol/L时，4种氟喹诺酮类抗生素均对GCDs具有荧光增强效应，因此可以通过GCDs的荧光强度增加与否，判断是否存在氟喹诺酮类抗生素。4种氟喹诺酮类抗生素对GCDs的荧光增强效应从强到弱为：ENR>CPR>NOR>OFL。同时，在OFL存在时，GCDs的荧光峰会发生红移，而其他三种均未出现此情况，因此可以根据此现象将OFL与其它种类的氟喹诺酮类抗生素进行区分。

图6 4种抗生素对GCDs荧光响应Fig.6 The fluorescence response of four fluoroquinolones on GCDs a.NOR；
b.OFL；
c.ENR；
d.CPR

由图6可知，GCDs对于4种喹诺酮类抗生素在0～50 μmol/L浓度下均表现出稳定的线性荧光增强响应，因此，GCDs可以用于喹诺酮类抗生素浓度的定量检测。相应的检测限根据LOD=3S/K计算得到，其中，S为20次重复测试标准差，K为标准曲线斜率。采用GCDs对NOR、OFL、ENR、CPR 4种氟喹诺酮类抗生素在0～50 μmol/L浓度范围内进行检测时，检测限分别为 1.305，2.178，0.753，1.035 nmol/L。宗婧婧等采用胶体金免疫层析法检测水产品中氟喹诺酮类抗生素，检测时间为3～5 min，恩诺沙星、环丙沙星等氟喹诺酮类抗生素的检出限在0.3～5 μg/kg[16]；
郑晶等采用酶联免疫吸附法快速检测鳗鱼中恩诺沙星残留，测试检测范围为0.3～10 μg/kg，最低检测线为3 μg/kg[17]；
康莉等采用高效液相色谱-串联质谱法检测水产品中的氟喹诺酮类抗生素残留分析方法，检测范围为0.20～5.00 mg/kg，检测限为0.50～31.4 μg/kg[18]。与其他研究相比，本实验所建立的基于GCDs荧光检测氟喹诺酮类抗生素的方法在检测范围和检测灵敏度上具有一定的优势。

(1)在石墨烯水溶液中加入过氧化氢，180 ℃加热85 min，得到对氟喹诺酮类抗生素具有荧光响应的GCDs。在GCDs浓度为50%，培育时间为10 min的检测条件下，对NOR、OFL、ENR、CPR 4种氟喹诺酮类抗生素在0～50 μmol/L浓度范围内进行检测时，检测限分别为1.305，2.178，0.753，1.035 nmol/L。

(2)在OFL存在时，GCDs的荧光峰会发生红移，而其他三种均未出现此情况，因此可以根据此现象将OFL与其它种类的氟喹诺酮类抗生素进行区分。

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